皮诺飞生物细胞 Brdu 实验服务介绍

皮诺飞生物的细胞 Brdu 实验服务，同样致力于细胞增殖的精准检测。Brdu，即 5 - 溴脱氧尿苷，是另一种胸腺嘧啶核苷类似物，在细胞进入 DNA 合成期（S 期）时，可替代胸腺嘧啶嵌入新合成的 DNA 链中。通过特异性抗 Brdu 单克隆抗体与 Brdu 的免疫结合反应，结合荧光标记二抗或酶促显色反应，能够间接检测 DNA 复制活性，从而反映细胞增殖状态。该技术广泛应用于细胞生物学、肿瘤学、药理学等领域，尤其适用于组织切片中细胞增殖检测、长期细胞增殖追踪及与其他细胞标志物的共定位分析。

实验方法

1. 细胞培养与 Brdu 掺入：取对数生长期细胞，按 2×10⁵个 /mL 浓度重悬后接种于 96 孔板（每孔 100μL），37ºC 孵育过夜。根据实验需求加入处理因素后，加入 Brdu 工作液（终浓度 5-10μM），继续 37℃孵育 4-24 小时（孵育时间需根据细胞周期调整，确保充分掺入）。孵育结束后，弃去培养基，用 PBS 洗涤细胞 2 次。

2. 细胞固定与 DNA 变性：

◦ 固定：每孔加入 50μL 4% 多聚甲醛，室温固定 30 分钟，维持细胞形态。

◦ DNA 变性：弃去固定液，加入含 2M HCl 的通透液（0.5% Triton X-100），室温孵育 30 分钟，使 DNA 双链解开，暴露嵌入的 Brdu 位点，便于抗体结合。随后用 0.1M 硼酸钠溶液（pH 8.5）中和 2 次，每次 5 分钟，再用 PBS 洗涤 1 次。

1. 封闭与抗体孵育：

◦ 封闭：每孔加入 50μL 含 5% 牛血清白蛋白（BSA）的 PBS，室温封闭 1 小时，减少非特异性结合。

◦ 一抗孵育：弃去封闭液，加入稀释后的抗 Brdu 单克隆抗体（如 1:200 稀释），每孔 50μL，4℃孵育过夜或室温孵育 2 小时。孵育后用含 0.1% Tween-20 的 PBS（PBST）洗涤 3 次，每次 5 分钟。

◦ 二抗孵育：加入荧光标记的二抗（如 Alexa Fluor 488 标记二抗，1:500 稀释），每孔 50μL，室温避光孵育 1 小时，PBST 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

1. 细胞核染色（可选）：加入 DAPI 染液（终浓度 1μg/mL），每孔 50μL，室温避光孵育 5-10 分钟，PBST 洗涤 1 次，去除未结合染料。

2. 图像采集与分析：使用荧光显微镜或共聚焦显微镜采集图像，通过 ImageJ 软件计数 Brdu 阳性细胞数及总细胞数，计算增殖相关指标。

实验结果

1. 图像结果：荧光显微镜下，Brdu 阳性细胞的细胞核呈特异性荧光（如 Alexa Fluor 488 标记呈绿色），DAPI 染色的细胞核呈蓝色。对照组中，Brdu 阳性细胞数量较多，绿色荧光信号分布均匀；经增殖抑制处理的实验组，绿色荧光信号明显减少，细胞分布稀疏；增殖促进组则绿色荧光信号较对照组更密集，阳性细胞数量显著增加。

2. 定量分析结果：统计至少 3 个随机视野的 Brdu 阳性细胞率（Brdu 阳性细胞数 / 总细胞数 ×100%）。例如，对照组 Brdu 阳性细胞率约为 32%±3.1%，某化疗药物处理组（5μM 浓度）阳性率降至 8%±1.5%，统计学分析显示两组差异显著（P<0.01），表明药物可强效抑制细胞增殖；若某生长因子处理组阳性率升至 55%±2.8%（P<0.01），则说明该因子能显著促进细胞增殖。此外，通过荧光强度分析，可辅助判断 Brdu 掺入量，间接反映 DNA 复制速率。

3. 结果报告：为客户提供完整报告，包含原始荧光图像（明场、Brdu 荧光、DAPI 荧光及合并图像）、Brdu 阳性细胞率统计图表、统计学参数（均值、标准差、P 值）及结果解读，明确处理因素对细胞增殖的调控效应，为后续实验设计（如药物浓度优化、信号通路研究）提供数据支持。