皮诺飞生物茜素红染色实验（金属检测方向）的系统介绍 

实验介绍

茜素红染色（AlizarinRedSStaining）是一种经典的组织化学技术，通过蒽醌类染料茜素红磺酸钠与金属离子（尤其是钙离子）发生特异性螯合反应，形成橙红色至深红色复合物，从而定位并半定量检测生物样本中的金属沉积（如钙盐、铝盐等）。

核心原理

化学基础：茜素红（1,2二羟基蒽醌3磺酸钠）在弱碱性环境（pH8.3–8.5）中与二价金属离子（如Ca²⁺、Sr²⁺、Ba²⁺）结合，生成不溶性红色螯合物；对三价金属（如Al³⁺、Fe³⁺）则需酸性条件（pH4.2）。

特异性：钙离子结合后显色最显著（橙红色），但需注意铁、铝等金属的干扰（需结合普鲁士蓝染色排除）。

应用场景

|领域|检测目标|样本类型|

|骨生物学|成骨分化钙结节|细胞（干细胞、成骨细胞）|

|病理学|肿瘤钙化（乳腺癌、甲状腺癌）|组织切片（石蜡/冰冻）|

|心血管研究|动脉粥样硬化斑块钙化|血管组织|

|材料科学|生物材料钙化性能评估|植入物涂层细胞共培养体系|

|毒理学|金属离子沉积毒性（如铝中毒）|脑/肝肾组织|

实验流程

1.样本预处理

细胞样本：弃培养基→PBS清洗→4%多聚甲醛固定10–30分钟（避免振荡防止钙结节脱落）。

组织切片：

石蜡切片：二甲苯脱蜡→梯度乙醇水化→蒸馏水冲洗。

冰冻切片：直接水化，省去脱蜡步骤（分化时间缩短至3秒防溶解）。

2.染色与分化

|步骤|条件与参数|关键控制点|

|染色|0.1–1%茜素红染液（pH4.2或8.3），室温5–30分钟|骨组织需10分钟，细胞5分钟|

|分化去背景|0.1%盐酸乙醇分化5–15秒→流水冲洗3分钟|每2秒镜检，至间质无色|

|复染（可选）|0.05%核固绿1分钟→流水冲洗1分钟|过久会掩盖钙信号|

3.后处理与观察

脱水透明：梯度乙醇（80%→100%）→二甲苯透明（防切片浑浊）。

封片：中性树脂封片，轻压排除气泡。

显微成像：

普通光镜：钙沉积呈橙红色，细胞核淡绿色（若复染）。

偏振光镜：羟基磷灰石晶体显示双折射现象（特异性验证）。

送样要求

样本类型与处理

|样本形式|要求|

|活细胞|≥1×10⁶细胞，活性>90%；T25瓶贴壁运输（冻存需提供复苏验证报告）|

|组织切片|石蜡切片厚度4–6μm，冰冻切片8–10μm；标注固定液类型及时间|

|含金属样本|铁含量高者需预处理：3%盐酸浸泡10分钟→流水冲洗30分钟|

信息登记

必填：样本来源、金属暴露史、预期靶离子（如Ca²⁺、Al³⁺）。

特殊需求：是否需联合染色（如VanGieson胶原双染）、定量分析（图像软件测算面积）。

注意事项

操作风险控制

1.染色过度/不足：

过度→背景深红：更换新分化液，延长分化至15秒。

不足→信号弱：校准染液pH（钙检测需pH8.3，铝检测需pH4.2）。

2.脱片风险：

组织切片脱水不彻底→封片后浑浊：每级乙醇延至2分钟。

细胞钙结节脱落：移液时沿孔壁加液，避免直接冲击。

试剂与样本保存

茜素红染液：避光4℃保存≤3个月；pH值每周校准。

染色后样本：湿盒4℃保存≤2周，避免干燥失真。

干扰排除

假阳性：铁、铝离子干扰→染色前盐酸处理或联合普鲁士蓝染色。

边缘效应：多孔板外周孔用PBS填充，仅中央孔接种细胞（防蒸发不均）。

实验价值与拓展

定量化趋势：结合图像分析软件（如ImageJ），可计算钙结节面积占比，实现半定量评估成骨分化效率。

技术创新：

微流控芯片分选：提升高通量样本染色一致性。

活细胞动态染色：新型荧光茜素红衍生物实时监测钙化进程。

此方案兼容科研与临床场景，兼顾经典流程与前沿应用，建议结合具体金属检测目标优化pH与分化参数。对特殊样本（如原代细胞、共培养体系），需预实验验证染色窗口。

官网：www.pinuofei.com     预约电话：15392937510