前言  细胞划痕实验的基本概念：

细胞划痕实验（Wound Healing）是一种操作简单，经济实惠的研究细胞迁移/肿瘤侵袭的体外实验方法。这种方法的原理是，当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上划痕工具制造一个空白区域，空白区域的细胞被机械力去除掉了，通过一段时间的培养，观察细胞向无细胞区域迁移的情况，通过测量细胞的迁移距反映细胞的迁移能力。

细胞迁移的重要性

细胞迁移(cell migration)：也称为细胞移动、细胞爬行或细胞运动，是指细胞在接收到迁移信号或感受到某些物质的梯度后而产生的移动。

　　它参与到很多生理和病理的活动中，如下：

　　免疫：如淋巴细胞的定向迁移是其分化成熟和发挥功能的关键之一;

　　炎症：炎症反应重要的功能是将白细胞送到炎症灶，白细胞迁移到炎症部位并发挥其吞噬和组织损伤作用;

　　肿瘤转移：肿瘤转移是肿瘤恶化后常见的活动，如侵入淋巴管、血管后随脉管系统实现远处转移;

　　损伤修复：当机体发生损伤时，免疫细胞和血小板会迁移到损伤部位，参与消炎和凝血;

　　胚胎发育：胚胎期不同类型祖细胞迁移至特异靶位以保证各组织、器官的正常发育。

细胞划痕实验的基本原理

细胞划痕实验是目前测定细胞迁移运动与修复能力的常用也是简单的方法，基本原理是：在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕/伤口”，边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕/伤口”愈合。因其类似体外伤口愈合过程，又名伤口愈合实验（Wound-Healing Assay），广泛用于可以观察药物、基因等外源因素对细胞迁移和修复的影响。

细胞划痕实验步骤

标记六孔板

用marker笔在六孔板底部画平行线，平行线之间的距离0.5cm，为了保证后续拍照位置是相同的；

铺板

细胞重悬铺板，密度控制在第二天长满，若过夜后细胞完全长满，也可以适当延长培养时间，但如果细胞密度已经很大，尽量重新铺板，因为可能过一 天后细胞太满，会导致细胞状态逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡；

制造划痕

第二天用直尺比着使用10ul枪头制造划痕，划痕方向与标志线垂直，保持力度一致，尽量一次性划完，然后PBS冲洗3次，洗去漂浮的细胞

为了减少细胞增殖所引起的假阳性结果，降低细胞增殖对实验结果的影响，将完全培养基换成无血清培养基和低血清培养基（FBS＜2%继续培养细胞）；

拍照

拍照前用PBS冲洗3次，一般认为24h为细胞的一个周期，所以检测时间不要超过一个周期的时间，按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，

选择合适时间点拍照，如0h，6h，12h，24h后取出细胞于显微镜下拍照。

数据处理与绘图

使用image j分析每个时间点划痕的宽度或划痕的面积。

使用image pro plus 可以测量划痕位置的面积和高度，将面积除以高度可以得到平均的划痕宽度，将0 点的划痕宽度减去实验结束时的划痕的宽度，得到的就是细胞迁移的距离，然后使用距离值按如下公式进行计算migration index。

计算公式如为：migration index=migration distance of test group/migratance distance of control group

将3 次独立重复的数据都分析完后进行统计分析并绘制柱状图。

常见问题解答

1. 划痕实验为什么一般选择6孔板？

因为6孔板大小适中，可保证有相当距离的平直划痕，便于观察；当然若是需要高通量初筛时，也可以用12或者24孔板。

2. 为什么细胞的接种密度原则为：过夜为100%融合？

若过夜后细胞未100%融合，虽可以适当延长培养时间，但因细胞密度已经很大，所以细胞状态会逐渐变差，后续细胞可能不迁移而是凋亡。

3. 如何降低细胞增殖对迁移造成的假阳性结果？

① 使用无血清或低血清培养基(<2%)可降低细胞增殖对实验结果的影响；② 一般认为24h为细胞的一个周期，在选取合适的时间点（6，12，24h）检测划痕宽度时，不要超过细胞一个周期的时间；③  如果要单纯考虑细胞迁移，可以先用丝裂霉素（1μg/ml）处理1h，抑制细胞的分裂。

4. 如何确保拍照的观察点？

按照6孔板背后画线的垂直方向划痕，可以形成若干交叉点，划痕一次与5条定位线相交，就有10个可固定监测点，以解决了前后观察时位置不固定的问题。

5. 细胞不迁移怎么办？

避开细胞状态的影响，需要考虑细胞自身的迁移能力，并非所有细胞都适合划痕实验，以乳腺癌为例，乳腺癌细胞MCF-7几乎很难迁移，而MDA-MB-231具有很强迁移性。

6. 细胞划痕法有哪些不足？

① 适用的细胞类型范围小，一是需要迁移强的细胞，而且对无血清的环境有较强的忍受力（至少24h）然而很多肿瘤细胞系在无血清培养下，12h细胞凋亡就超过50%，因此细胞划痕法对部分肿瘤细胞并不适用。② 自身操作的实验误差，如划痕距离不一致等。

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