透射电镜

透射电镜（transmission electron microscopy，TEM） 因用电子束穿透样品、产生物像而得名。由于电子易被散射或被样品吸收，故穿透力低，须制备超薄切片（50～80mm）。取材要尽量新鲜，以保存细胞正常的超微结构。组织块（1mm³以内）用戊二醛与镍酸两次固定，脱水后树脂包埋，用超薄切片机切片，再经醋酸铀和柠檬酸铅染色。电子束射落到切片时，随细胞构成成分的密度以及吸附重金属铀、铅、俄的程度不同，而发生相应的电子散射。当电子束投射到密度大、吸附重金属多的结构（如溶酶体）时，电子被散射的多，因此，射落到荧光屏上的电子少而呈暗像，电镜照片上呈黑或深灰色，习惯称该结构为高电子密度（electron-density）；反之呈浅灰色，称低电子密度。透射电镜可以看到在光学显微镜下无法看清的小于0.2um的细微结构，这些结构称为亚显微结构或超微结构，小分辨率0.2nm。

透射电镜应用

形貌观察：

可观察纳米尺度的微观形貌

如：动植物的细胞器 纳米材料 病毒细菌等

分析：

电子衍射花样：晶格点阵 晶体结构

能谱EDS分析：元素分析 定性半定量

扫描透射STEM：明场像 暗场像

其他：如原位 冷冻 三维重构

透射电镜制样流程

取材-固定-脱水-渗透-包埋-修块-定位-切片-染色-拍照

透射电镜固定剂

前固定：戊二醛（Glutaric dialdehyde C5H8O2）

戊二醛的优点是对糖原，糖蛋白，微管，内质网和细胞基质等有较好的固定作用，对组织和细胞的穿透力比四氧化锇强，还能保持某些酶的活力，长时间的固定（几周甚至1-2个月）不会使组织变脆。

缺点：对脂类无固定作用，无电子染色作用，对细胞膜的显示较差。

后固定：四氧化锇（osmium tetroxide）

是一种氧化剂，与氮原子有较强的亲和力，因而对于细胞结构中的蛋白质成分有良好的固定作用。它还能与不饱和脂肪酸反应使脂肪得以固定。此外，四氧化锇还能固定脂蛋白，使生物膜结构的主要成分磷脂蛋白稳定。它还能与变性DNA以及核蛋白反应，但不能固定天然DNA，RNA及糖原。四氧化锇固定剂有强烈的电子染色作用，用它固定的样品图像反差较好。锇固定的时间一般为1-2小时。

缺点：渗入组织慢，不能固定糖原、核酸及糖类，有剧毒。

透射电镜样本处理

首先需要做电镜的样本必须尽量新鲜，固定液或悬浮液都不得冷冻结冰

1 动物组织样本

在1-3分钟内取样，取样组织1立方毫米，尽量薄，可在4度预冷电镜固定液内修整大小，超时后会有细胞器损伤；取材时尽量精确到需要观察的目标部位进行固定，坏死比较严重的灶点可取病灶周边代替；取材时一定注意避免镊子挤压等机械损伤，刀片要锋利避免挫伤组织，可使用刮胡刀双面刀片。组织取下后立即投入电镜固定液内，室温避光固定2小时，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输，在保存和运输过程中固定液切勿冷冻结冰。

2 植物组织样本

取材要求同动物组织样本，尽可能的新鲜；另外组织投入固定液后需要进行真空抽气让组织沉底，如无条件抽气可用滤纸或脱脂棉将组织压入进固定液内，组织不能漂浮在固定液表面。

3 细胞样本

贴壁细胞：

方法一：

培养好的细胞弃培养基，加入2.5％的常温戊二醛固定液；常温固定5分钟左右，用细胞刮（或软橡胶盖切得平整小方块）沿一个方向轻轻刮下细胞，切记不要反复刮，避免细胞刮破。用巴氏吸管把细胞液注入离心管内，加入离心机（不超过3000转），离心2分钟左右，细胞团要有绿豆大小；弃固定液后加新的电镜固定液，把细胞团轻轻挑起或者吹散，悬浮于固定液中；室温避光固定30分钟，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输。

方法二：（对细胞形态没有要求的）

培养好的细胞弃培养基，加入胰酶；胰酶消化好后（时间不宜过长），用培养基终止消化，用吸管把细胞吹下来。回收离心管，离心（不超过3000转），2分钟左右，细胞团要有绿豆大小；弃上清，加入2.5％的常温戊二醛固定液，把细胞团轻轻挑起，悬浮于固定液中；室温避光固定30分钟，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输。

悬浮细胞：离心收集细胞要肉眼可见细胞沉淀绿豆大小，弃培养基后加电镜固定液室温避光固定30分钟，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输。

4 细菌样本

固体培养基的细菌：连带着培养基一起挑下细菌放于电镜固定液内部室温避光固定2小时，再转移至℃保存，4℃冰袋运输。

悬浮细菌孢子等：离心收集细菌要肉眼可见细菌沉淀绿豆大小，弃培养基后加电镜固定液室内避光固定2h，再转移至4℃保存，4℃冰袋运输。

5 病毒

破碎组织细胞，粗离心去除细胞碎片取上清，超速离心分离出病毒（病毒提取的过程需要客户自己完成）。用缓冲液（如PBS）悬浮病毒，至少50ul，远距离-80℃冻存运输，近距离4℃保存运输，尽快滴片做负染后及时电镜观察拍照。

6 外泌体囊泡等

客户自己完成外泌体囊泡等的提取收集，至少50ul，用缓冲液（如PBS）或试剂盒中的保存液悬浮液，远距离-80℃冻存运输，近距离4℃保存运输，尽快制片做负染（因此类样品极易降解，样品越新鲜越好，数小时内完成滴片负染，否则造成的效果很不理想甚至完全观察不到）。

7 纳米材料等无机材料

直接准备粉剂或用缓冲液（如PBS）、纯水、无水乙醇悬浮，常温保存运输即可（需要超声的备注），做负染后电镜观察拍照。

实验图例