HE染色是病理检测的“基石”，但很多特殊结构——胶原纤维、脂质、糖原、多种抗原共定位——HE染不出来，也染不清楚。

当实验需要回答“胶原沉积程度如何？”“脂质蓄积在哪里？”“糖原分布是否异常？”“多个标记物是否共定位？”这些问题时，就需要特殊染色和多色标记技术登场了。

我们把4种最常用的特殊染色与多色标记技术拆开讲透——Masson、油红O、PAS、免疫荧光多标——帮你根据研究需求选对方法。

免疫荧光多标

【01 Masson三色染色：胶原纤维的“金标准”】

Masson染色是显示胶原纤维最经典的方法，广泛应用于肝纤维化、肾纤维化、心肌纤维化等组织病理学评估。

染色原理：
Masson染色利用三种不同分子大小的染料对组织进行分步染色。小分子染料（丽春红/酸性品红）先进入所有组织，大分子染料（苯胺蓝/亮绿）随后只能进入孔径较大的胶原纤维，从而实现肌纤维（红色）和胶原纤维（蓝色/绿色）的分化。

适用范围：

• 肝纤维化/肝硬化分级评估

• 肾小球硬化/肾间质纤维化

• 心肌纤维化/血管重塑

• 肺纤维化/特发性肺纤维化

结果判读：

关键操作要点：

• 分色是关键：在酸性溶液（1%乙酸）中分色，随时镜下观察，肌纤维红色清晰、胶原纤维蓝色鲜明时终止

• 脱水要迅速：避免过度脱水导致胶原颜色褪去

• 控制变量：不同批次染色时间需保持一致，确保定量可比性

【02 油红O染色：脂质检测的不二之选】

油红O是检测组织中中性脂质和脂肪酸最常用的染色方法，广泛应用于代谢性疾病研究。

染色原理：
油红O是一种脂溶性偶氮染料，其在脂质中的溶解度高于在有机溶剂中的溶解度，因此能从染液中“析出”并溶解进入脂质滴中，使脂质呈现红色。

适用范围：

• 脂肪肝/肝脏脂肪变性评估（冰冻切片）

• 动脉粥样硬化斑块脂质沉积

• 脂肪组织/脂质代谢研究

• 细胞内脂质蓄积检测

结果判读：

关键操作要点：

• ⚠️ 必须使用冰冻切片——石蜡切片有机溶剂处理会溶解脂质

• 染色时间：室温 10-15min（需覆盖组织）

• 分色：60%异丙醇分化 2-5s（迅速！脂质易被过度脱色）

• 固定：4%多聚甲醛或10%中性福尔马林（切忌含酒精的固定液）

• 封片：甘油明胶封片（切忌二甲苯类封片剂，会溶解脂质）

【03 PAS染色：糖原与中性黏液的“照妖镜”】

PAS（高碘酸-雪夫反应）是显示糖原、黏蛋白、真菌等含1,2-乙二醇基团物质的重要方法。

染色原理：
高碘酸将糖原中相邻乙二醇基团氧化为醛基，雪夫试剂（无色品红）与醛基反应生成紫红色沉淀，从而显示糖原位置。

适用范围：

• 肝脏/肌肉糖原蓄积疾病（糖原贮积症）

• 肾小球基底膜增厚（糖尿病肾病）

• 真菌感染（真菌细胞壁PAS阳性）

• 黏液分泌肿瘤的鉴别

结果判读：

关键操作要点：

• 高碘酸氧化时间：5-10min（过长导致背景高，过短反应不充分）

• 雪夫试剂染色：10-20min（避光！）

• 对照设置：一定要设淀粉酶消化对照—糖原在淀粉酶消化后PAS反应消失，其他PAS阳性物质不受影响，帮助鉴别糖原还是其他物质

• 固定：10%中性福尔马林或Carnoy固定液

【04 免疫荧光多标：多重蛋白同时检测】

免疫荧光多标（IF多标）利用不同种属一抗和不同荧光染料标记的二抗，在一张切片上同时检测多个目标蛋白的定位与共定位关系。

染色原理：
不同种属来源的一抗（如兔源抗A、小鼠源抗B、大鼠源抗C）分别与对应的荧光二抗（如抗兔-AF488绿色、抗小鼠-AF555红色、抗大鼠-AF647远红）结合，通过不同激发光通道分别成像。

多标染色设计原则：

• 一抗宿主种属必须不同（否则二抗交叉反应）

• 荧光染料光谱分离充分（避免串色）

• 从最“难”的抗原开始染色（信号弱的先做）

荧光通道常用组合：

关键操作要点：

• 封闭：5%正常血清（含二抗宿主种属的血清）

• 一抗混合孵育：4℃过夜

• 二抗混合孵育：室温 30-60min（避光）

• ⚠️ 全程避光操作！从二抗孵育开始，所有操作在暗处进行，封片剂含抗淬灭剂

• 即刻成像或4℃避光保存（信号随时间衰减）

• 严格设置单标对照和同型对照，排除串色和背景

【05 四种方法快速选择指南】

【06 常见问题快查】

【结语】

特殊染色和多色标记技术，是HE染色之外的重要补充。胶原纤维看Masson，脂质看油红O，糖原看PAS，多蛋白共定位看IF多标——选对方法、优化操作、严格质控，病理检测就能从“看见了”升级到“看得清、测得准”。