主图：透射电子显微镜原理与成像效果示意图

（一幅合成图：左侧为透射电镜结构原理图，电子枪发射电子束穿透超薄样品，经电磁透镜放大成像；右侧为心肌细胞超微结构图，清晰显示肌丝、Z线、线粒体等结构）

在生命科学研究的微观世界里，光学显微镜让我们看到了细胞，而透射电子显微镜（Transmission Electron Microscope，TEM）则让我们窥见了细胞的“五脏六腑”——线粒体的嵴、内质网的腔、细胞核的孔、甚至单个蛋白质分子的形态。它如同一只“纳米之眼”，以亚纳米级别的分辨率，为我们揭开了生命超微结构的神秘面纱。

今天，让我们一同走进透射电镜的精彩世界，了解这项诺奖级技术如何从样本制备到高清成像，解码生命的微观密码。

一、什么是透射电子显微镜？

透射电子显微镜是一种利用电子束穿透超薄样品并成像的精密仪器。与光学显微镜使用可见光不同，TEM使用波长极短的电子束作为光源，根据德布罗意物质波理论，高速运动的电子具有波动性，其波长与加速电压的平方根成反比。

核心原理简述：高能电子束穿透经特殊制备的超薄组织切片（厚度50-100 nm），电子与样品中的原子发生相互作用产生散射。未散射或小角度散射的电子通过物镜形成明场像，最终在荧光屏或CCD相机上成像。

关键性能指标：

图示：光学显微镜与透射电镜分辨率对比图

（图片：左侧光学显微镜下细胞轮廓模糊，右侧透射电镜下线粒体嵴、内质网等超微结构清晰可辨）

二、成像原理：电子与物质的相互作用

透射电镜的成像机制基于电子散射衬度，即样品中不同结构对电子散射能力的差异。

（一）衬度形成机制

当电子束投射到样品时，可随组织构成成分的密度不同而发生相应的电子散射：

• 电子密度高：电子束投射到质量大的结构时，电子被散射得多，因此投射到荧光屏上的电子少而呈暗像，电子照片上则呈黑色

• 电子密度低：反之，电子被散射得少，荧光屏上亮，照片上呈浅色

（二）为什么能看清细胞器？

生物样品中不同细胞器的电子密度存在差异：

• 线粒体、溶酶体：膜结构丰富，电子密度较高

• 细胞核：染色质致密，电子密度高

• 细胞质基质：相对稀疏，电子密度低

这种天然的电子密度差异，加上重金属染色的增强，使得各种细胞器在电镜下清晰可辨。

三、仪器主要构成

透射电镜是一台精密复杂的仪器，主要由以下系统组成：

（一）电子照明系统

• 电子枪：发射高能电子束（热发射或场发射）

• 聚光镜：将电子束聚焦到样品上

（二）成像系统

• 物镜：形成原始放大图像

• 中间镜和投影镜：进一步放大并投射到荧光屏

（三）样品系统

• 样品台：五轴马达控制，可精确移动和复位

• 真空系统：维持高真空，防止电子与空气分子碰撞

（四）图像记录系统

• 荧光屏：直接观察成像

• CCD/CMOS相机：数字化图像采集

主流生物型透射电镜型号：

• Hitachi H-7650：日立公司生产，分辨率0.2 nm，加速电压40-120 kV

• JEOL JEM-1230：日本电子生产，晶格分辨率0.20 nm，放大倍数1000-600,000倍

皮诺飞生物透射电镜设备:

四、样本制备：成败的关键

透射电镜观察的是电子束穿透的样品，要求样品厚度低于100纳米，且必须在高真空中观察。因此，样本制备是TEM成功的关键，也是最考验技术人员功底的环节。

图示：透射电镜样本制备流程图

（图片：纵向流程图，从“取材→前固定→漂洗→后固定→脱水→浸透→包埋→聚合→超薄切片→染色→电镜观察”共11个步骤）

（一）生物样品完整制备流程

Step 1 取材

• 要求：组织离体后立即固定，防止自溶

• 大小：1 mm³ 小块（便于固定液渗透）

• 温度：4℃低温操作

Step 2 前固定（戊二醛固定）

• 固定液：2.5%戊二醛（磷酸缓冲液配制）

• 温度：4℃

• 时间：1-2小时（小组织）至数小时（大组织）

• 目的：交联蛋白质，保持细胞结构稳定

• 注意：戊二醛固定效果好，但可能掩盖抗原性（后续做免疫电镜需注意）

Step 3 漂洗

• 缓冲液：0.1 M 磷酸缓冲液

• 次数：3次，每次10-15分钟

• 目的：去除残留戊二醛，防止与后续试剂反应

Step 4 后固定（锇酸固定）

• 固定液：1% 锇酸（OsO₄）

• 温度：4℃

• 时间：1-2小时

• 目的：
        

￮ 固定脂质（细胞膜、线粒体膜等）

￮ 增加电子密度，增强对比度

￮ 稳定细胞结构

• ⚠️ 重要安全提示：锇酸剧毒、易挥发，必须在通风橱中操作，避免光照

Step 5 脱水

使用梯度乙醇或丙酮脱水，去除水分，为树脂渗透做准备：

• 50% → 70% → 80% → 90% → 95% → 100% × 3次

• 每步10-15分钟

Step 6 浸透与包埋

• 浸透：将组织依次放入环氧丙烷与包埋树脂的混合液中，逐步置换

• 包埋：将组织转入包埋模具，加入新鲜树脂（如Epon812）

• 聚合：60-70℃烘箱中聚合24-48小时，形成坚硬树脂块

Step 7 超薄切片

• 设备：超薄切片机（Ultramicrotome）

• 刀：金刚石刀

• 切片厚度：50-100 nm（比头发丝细1000倍！）

• 收集：将切片捞取于铜网（如200目铜网）上

Step 8 电子染色

为增强图像衬度，使用重金属盐对切片进行染色：

• 醋酸双氧铀：染色细胞核、膜结构，5-10分钟（弱放射性）

• 柠檬酸铅：染色膜结构，5-10分钟（需避CO₂，防止碳酸铅沉淀）

安全提示：醋酸双氧铀和柠檬酸铅均有毒，操作需戴手套，在通风处进行。

Step 9 电镜观察

• 将铜网放入电镜样品台

• 在60-120 kV电压下观察

• 调整聚焦、对比度、放大倍数

• 拍摄图像（常用5,000×-100,000×）

（二）石蜡电镜技术：常规电镜的补救手段

临床实践中，肾穿刺组织微小，可能出现送检常规电镜组织中未见肾小球的情况。此时可采用石蜡电镜技术作为补救手段：

操作流程：切取石蜡包埋组织块中需要观察的部位→二甲苯等溶媒脱蜡→重新用环氧树脂Epon812包埋→进行透射电镜标本制作→超微结构观察。

临床应用案例：南昌大学第一附属医院成功运用石蜡电镜技术诊断Alport综合征。患者肾活检组织光镜提示轻度系膜增生，常规电镜未见肾小球，通过石蜡电镜技术发现基底膜致密层节段增厚，呈撕裂状和分层样改变——这是Alport综合征的特异性表现，后续基因检测证实COL4A5基因突变。

五、临床应用：肾脏病理诊断的“金标准”

透射电镜在临床诊断中最成熟、最广泛的应用当属肾脏病理。它能直接观察肾小球基底膜、足细胞、免疫复合物沉积等超微结构变化，为肾小球疾病的精准分型提供不可替代的依据。

（一）肾脏病理中的典型应用

（二）临床案例：罕见法布雷病的精准诊断

30岁的小于被胸闷、胸痛困扰三年，心电图T波倒置但冠脉造影正常，近几个月尿蛋白显著升高，血肌酐达231 μmol/L。其母亲与舅舅皆因尿毒症去世，家族史提示遗传倾向。

上海市第十人民医院肾内科为小于行肾穿刺活检。免疫荧光阴性，排除免疫复合物沉积；特殊染色提示局灶节段硬化；透射电镜下发现了特征性的“层状足细胞包涵体”（斑马小体），诊断指向法布雷病。

后续血液α-半乳糖苷酶活性检测及基因检测证实诊断。使用阿加糖酶α注射液治疗后，小于的心功能、肾功能损害得到控制。

法布雷病是一种罕见的X连锁遗传病，发病率仅为1/11000～1/40000，已列入国家《第一批罕见病目录》。如果没有透射电镜的精准诊断，小于可能长期被误诊为普通肾病。

（三）皮肤科与遗传性皮肤病

透射电镜在皮肤科领域同样具有重要价值：

• 大疱性表皮松解症：显示半桥粒、锚定纤维的缺陷

• 毛发疾病：毛小皮异常、毛干结构分析

• 结缔组织病：胶原纤维排列异常

（四）微生物与病毒感染

透射电镜可直接观察病毒形态、细菌结构、外泌体等纳米结构：

• 病毒鉴定：冠状病毒、流感病毒、HIV等形态学鉴定

• 细菌超微结构：细胞壁、细胞膜、质粒、鞭毛

• 外泌体观察：负染色法检测纳米级外泌体

六、观察对象：从细胞器到纳米材料

透射电镜的应用范围极为广泛，涵盖了生物医学和材料科学的多个领域：

（一）亚细胞超微结构

• 细胞核：核膜、核孔、染色质、核仁

• 线粒体：嵴、基质、内外膜

• 内质网：粗面内质网（附核糖体）、滑面内质网

• 高尔基体：扁平囊泡、分泌泡

• 溶酶体：电子致密颗粒

• 细胞连接：紧密连接、缝隙连接、桥粒

（二）细胞病理学改变

• 肿瘤细胞超微结构特征

• 细胞损伤与死亡（凋亡、坏死）

• 代谢性疾病的细胞器改变

（三）纳米结构检测（负染色法）

• 细菌、病毒

• 外泌体

• 纳米颗粒、纳米管

• 蛋白质复合物

图示：常见细胞器超微结构识别图

（图片：胆固醇结晶、凋亡、肝线粒体、胶原纤维、血脑屏障、皮肤肥大细胞）

七、特殊技术与前沿发展

（一）负染色技术

用于检测纳米级结构的快速方法：将样品与重金属盐（磷钨酸、醋酸铀）混合，铺于铜网，干燥后观察。背景被染成深色，样品颗粒呈浅色“负染”效果。

（二）免疫电镜

利用胶体金标记抗体，在超薄切片上定位特定抗原。可在包埋后（Post-embedding）或包埋前（Pre-embedding）进行。

（三）冷冻电镜（Cryo-EM）

将样品快速冷冻至液氮温度，在玻璃态冰中观察生物大分子的天然结构。2017年诺贝尔化学奖授予该技术的三位开拓者。单颗粒冷冻电镜技术已能解析近原子分辨率的三维结构，彻底改变了结构生物学。

（四）三维电镜技术

• 连续切片三维重建：获取系列超薄切片，计算机重建三维结构

• FIB-SEM：聚焦离子束扫描电镜，原位切割与成像

• 电子断层扫描：倾转样品，获取系列投影，重建三维结构

（五）人工智能辅助分析

AI算法正在被开发用于自动识别超微结构、量化形态参数、辅助诊断。例如，针对原发性纤毛运动障碍诊断中动力蛋白臂识别的背景噪声问题，已有新型图像分析工具可平均轴丝外周微管双联体，提高信号并降低背景噪声。

八、透射电镜的优势与局限

（一）核心优势

（二）局限性与挑战

九、技术展望

（一）原位结构生物学

冷冻FIB提升技术可从组织或大细胞中制备高质量TEM样品，实现原位结构生物学研究。利用聚焦离子束减薄，可从高压冷冻组织块中制备电子透明薄片，直接观察天然组织环境中的分子结构。

（二）多尺度关联成像

关联光学和电子显微镜（CLEM）结合荧光显微镜的分子特异性与电镜的超微结构分辨率，在同一细胞上获取多层次信息。

（三）自动化与高通量

自动聚焦、自动消像散、自动拍照等功能已逐步普及，未来有望实现高通量电镜成像和大数据自动化分析。

（四）临床诊断标准化

随着石蜡电镜等技术的成熟，以及AI辅助诊断系统的开发，透射电镜在临床病理诊断中的应用将更加便捷、精准、普及。

十、结语

透射电子显微镜，这只透视生命微观世界的“纳米之眼”，自1931年诞生以来，已走过近百年历程。从细胞器的首次发现，到病毒结构的解析，再到蛋白质分子的原子分辨率成像，它始终站在生命科学探索的最前沿。

在临床诊断中，它让遗传性肾病不再“无迹可寻”，让罕见病不再“难以确诊”；在科学研究中，它让我们得以窥见生命的精妙设计——线粒体的能量工厂、内质网的蛋白质生产线、细胞核的遗传信息库。

每一次成功的电镜观察，都是对生命微观世界的一次深度对话。从1 mm³的组织块，到50 nm的超薄切片，再到0.1 nm的分辨率，透射电镜让我们看到了一个肉眼无法企及的精彩世界。这，就是纳米之眼带给我们的科学之美。

附录：透射电镜资源与服务

（一）收费标准参考（中国台湾地区国家卫生研究院）

注：上机样品需提前2-3天交付进行真空干燥。

（二）主要设备供应商

（文末说明）

本文旨在科普教育，所涉及实验操作应严格遵守实验室安全规范及标准操作程序（SOP）。锇酸、醋酸双氧铀、柠檬酸铅等试剂具有毒性，需在通风橱中操作并妥善处置废液。临床诊断性检测必须由经过认证的病理科在质量控制体系下完成，结果需由专业病理医师结合所有临床信息进行综合解读。文中示意图为原理示意，具体仪器参数和操作流程请以实际设备说明书和实验室SOP为准。

核心口诀：

透射电镜纳米眼，电子束穿超薄片；

分辨率高千倍提，细胞器里看得见；

取材固定要迅速，戊二醛前锇酸后；

脱水包埋树脂硬，超薄切片五十纳米；

铀铅染色增衬度，真空观察防干扰；

参考资料：

中国中医科学院医学实验中心.透射电子显微镜

2. 北京欧波同光学技术.从样本制备到高清成像：电子显微镜完整工作流程指南

3. 南昌大学第一附属医院.石蜡电镜技术助力临床诊断遗传性肾病

4. UC San Diego. A new tool improves diagnostic test performance for transmission EM evaluation of axonemal dynein arms

5. 湖南农业大学学报.透射电子显微镜

6. 皮诺飞.动物组织的透射电镜

7. 大众医学.尿毒症也会遗传？上海十院肾内科依托透射电镜精准诊断罕见法布雷病患者

8. Türkiye Klinikleri. ELECTRON MICROSCOPY

9. 国家卫生研究院（中国台湾）.生物型穿透式電子顯微鏡

10. Karolinska Institutet. FIB milling with liftout