1.引言
CRISPR-Cas9技术因其高效、精准的基因编辑能力，已成为构建大鼠基因敲除（KO）模型的首选方法。相较于传统方法（如ES细胞打靶），CRISPR技术周期短、成本低，适用于大规模基因功能研究。皮诺飞生物基于多年CRISPR大鼠模型构建经验，提供从sgRNA设计到表型分析的一站式服务，成功构建超过500种基因敲除大鼠模型，广泛应用于疾病机制研究、药物开发和功能基因组学。
本文将系统介绍CRISPR大鼠基因敲除模型的构建流程、关键优化点、常见问题及解决方案，并结合皮诺飞生物的特色服务，为研究者提供标准化操作指南。
2.CRISPR大鼠基因敲除模型构建流程
2.1靶点设计与sgRNA优化
（1）基因结构分析
-确定目标基因的外显子区域（优先选择首个功能域或关键外显子）
-避免脱靶效应：使用CRISPRscan、CHOPCHOP等工具预测sgRNA效率
-皮诺飞生物提供AI辅助sgRNA设计服务，脱靶率<0.1%
（2）sgRNA合成与验证
|步骤|关键参数|
|sgRNA合成|化学修饰（2'-O-methyl增强稳定性）|
|体外验证|T7E1酶切或Sanger测序检测切割效率|
|优化方案|若效率<60%，需重新设计sgRNA|
2.2胚胎显微注射与基因编辑
（1）受精卵准备
-选用SD或Wistar大鼠（6-8周龄，SPF级）
-超排卵处理（PMSG+hCG方案）
（2）CRISPR组分注射
-注射方案：
-Cas9mRNA+sgRNA（常用，减少脱靶风险）
-RNP（核糖核蛋白复合物）（编辑效率更高）
-显微注射参数：
-注射体积：1-2pL/胚胎
-Cas9浓度：50-100ng/μL
（3）胚胎移植
-注射后胚胎培养至2-细胞期
-移植至假孕母鼠（移植存活率>80%）
2.3基因型鉴定与建系
（1）初筛（F0代）
-PCR+测序检测突变类型（Indel、大片段缺失等）
-TIDE分析计算编辑效率
（2）稳定品系建立（F1代）
-筛选杂合子（+/-）进行互配
-Southernblot或长片段PCR验证纯合子（-/-）
3.关键优化点与常见问题
3.1提高编辑效率的策略
|影响因素|优化方案|
|---------|---------|
|sgRNA设计|选择高GC含量（40-60%）区域|
|Cas9递送方式|RNP比质粒更高效|
|胚胎质量|使用新鲜受精卵（<2h内注射）|
3.2常见问题与解决方案
|问题|可能原因|解决方案|
|------|---------|---------|
|低编辑效率|sgRNA设计不佳|重新优化sgRNA|
|高嵌合率（F0）|注射时间延迟|使用早期胚胎（原核期）|
|脱靶效应|sgRNA特异性低|选择高评分sgRNA或使用HiFiCas9|
4.皮诺飞生物特色服务
4.1一站式CRISPR大鼠模型构建
-从设计到表型分析全程服务
-3个月快速交付（传统方法需6-12个月）
4.2基因编辑质控体系
|检测项目|方法|
|---------|------|
|脱靶分析|全基因组测序（WGS）|
|表型验证|WB/qPCR/免疫组化|
4.3典型应用案例
-案例1：构建ApoE敲除大鼠（动脉粥样硬化研究）
-案例2：IL-10KO大鼠（炎症性肠病模型）
5.结论
CRISPR技术极大促进了大鼠基因敲除模型的构建效率，但仍需优化sgRNA设计、胚胎操作和基因型鉴定等关键步骤。皮诺飞生物提供高成功率、低脱靶率的CRISPR大鼠模型构建服务，助力基因功能研究与药物开发。
如需获取详细技术方案或案例数据，请联系皮诺飞生物技术团队！www.pinuofei.com 15392937510。
