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产品信息

产品简介

TUNEL(TdT mediated  dUTP Nick End Labeling) 技术可对组织或细胞中凋亡小体或单个凋亡细胞进行染色，能准确反映细胞凋亡最典型的生物化学和形态特征。凋亡细胞内的内源性核酸内切酶被激活而将自身染色体DNA切断成产生大量的3-OH 末端片段，利用这一特点，用脱氧核苷酸末端转移酶 (Terminal Deoxynucleotidyl Trans-ferase,TdT)  将标有标记物 (dUTP-生物素)的脱氧核苷酸转移到3-OH 末端，再与HRP标记的链酶亲和素以及TYR488结合后,从而将凋亡信号标记出来。

本试剂盒应用范围广，分步法适用于白光TUNEL显色，也适用于荧光底物显色。可以用于检测冷冻或石蜡切片中的细胞凋亡情况，也可以检测培养的贴壁细胞或悬浮细胞的凋亡情况。

储存与运输

冰袋 (wetice)     运输 ；本试剂盒储存在-20℃,有效期12个月。

试剂组成

试剂配制

Tunel孵育液：

操作步骤

一、样品准备

A.石蜡包埋组织切片

1.室温下将组织石蜡切片放入二甲苯中浸泡5-10min, 重复2-3次；然后无水乙醇 浸泡5min,重复2次；最后用梯度乙醇(85% 、75% 、双蒸水)各浸泡1次 ，每次 5min;

2.用PBS轻轻润洗切片，并去掉样本周围多余液体；使用组化笔沿组织外围轮廓画 一个与组织间隔2-3mm 的小圈，便于下游通透性处理和平衡标记操作；在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在 湿盒中保持样本的湿润；

3.配制Proteinase  K工作液：按1:99的比例，用PBS 作为稀释液来稀Proteinase K作为工作液；

4.每个样本上滴加50μL上述 Proteinase  K工作液，使其被全部覆盖，37℃孵育 20min;

5.用PBS溶液浸润清洗样本3次，每次3min    (处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润)。

B.组织冰冻切片

1.将玻片浸没在4%多聚甲醛溶液(溶于PBS) 中固定，室温下孵育10-15min ;

2.片子从固定液中取出后，通风橱中自然晾干；

3.将玻片放入纯水或PBS 中润洗，去掉玻片上残存的固定液；

4.用组化笔沿着组织外围轮廓画一个与组织间隔2-3mm 的小圈，便于下游通透性，处理和平衡标记操作；在实验过程中，切勿让样品干燥，处理好的样本放在湿盒中保持样本的湿润；

5.配制Proteinase  K工作液：按1:99的比例，PBS作为稀释液来稀释ProteinaseK作为工作液；

6.每个样本上滴加50μL上述Proteinase  K工作液，使其被全部覆盖，37℃孵育10min;

7.用PBS溶液浸润清洗样本3次，每次3min (处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润 ) 。

C.细胞爬片

1.在Lab-Tek 载玻片小室 (Chamber Slides) 上培养贴壁细胞，在凋亡诱导处理之后，用PBS轻轻润洗3遍载玻片；

2. 向每个载玻片小室中加入适量的4%多聚甲醛溶液(溶于 PBS)   固定，室温下孵育20min;

3.去掉固定液，加入PBS 清洗3次，每次3min ;

4.每个样本浸于破膜液中 ，室温孵育5min 进 行 通 透 处 理 ( 注意 ：推荐用Proteinase K工作液消化，37℃处理10min 左右，视细胞状态调整 。若细胞易掉 片则建议选择用破膜液处理) ;

5.在盛有PBS 溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；

6.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体。处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

D.细胞涂片

1.以约2×107个细胞/mL  的浓度将细胞重悬于PBS 中 ，吸取50-100μL细胞悬液 滴于防脱玻片上 ，使用一片洁净的载玻片轻柔涂开细胞悬液；

2.将玻片浸入装有4%新鲜配制于PBS中的多聚甲醛的染色缸中，固定细胞 ，在4℃放置25min ;

3.将玻片浸入PBS中 ，室温放置5min 浸洗，重复一次；

4.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干玻片上样本周围多余的液体，用组化笔沿着细胞外围轮廓画一个小圈 ，便于下游透性处理和平衡标记操作 ，在实验过程中， 切勿让样品干燥；

5.每个样本浸于破膜液中 ，室温孵育5 min 进行通透处理(注意： 推荐用2-20  μ g/mL 的 Proteinase K工作液消化，37℃处理10 min 左右，视细胞状态调整 。 若细胞易掉片则建议选择用破膜液处理) ;

6.在盛有 PBS 溶液的敞口烧杯中浸没清洗样本2-3次；

7.轻轻去掉多余液体，并用滤纸小心吸干载玻片上样本周围的液体 ，处理后的样本放在湿盒中保持样本的湿润。

二 、标记与检测

1.标记液配制： 按照上述比例配制Tune l孵育液；

2.标记： 在每份组织样本上加入50μL上述孵育液 ，在37℃孵育2-3 h ; 注意不能干片 ，载玻片要避光；

3.立即用PBS润洗组织样本 ，清洗3次 ，每次5 min ;

4.用滤纸轻轻擦掉样本周围的 PBS 溶液；

5.配制HRP标记液：用PBST或者PBS 按1:200配制，每张切片滴加50ul左右，在37℃孵育1 h; 注意不能干片，载玻片要避光；

6.立即用 PBS 润洗组织样本，清洗3次，每次5 min;

7.用TSA buffer稀释TYR 488，稀释比1:1500-2000,室温孵育30 min后，PBS润洗组织样本，清洗3次，每次5 min;

8.核染色：在每份组织样本上加入50 μL DAPI,室温孵育1-3 min;

9.封片：样本染色完成后，用 PBS 清洗组织样本3 次，每次5 min, 然后轻轻去掉多余液体，封片；

10.镜检：立即在荧光显微镜下分析样本，载玻片注意避光， DAPI能将凋亡和未凋亡的细胞核着色。

结果说明：

凋亡的细胞染色体断裂是渐进的。染色体DNA 首先在内源性的核酸水解酶的作  用下降解成较大的片段，之后部分染色体DNA 在 Ca²+和 Mg²+ 依赖的核酸内切酶作 用下，在核小体单位之间被随机切断，形成较小片段的核小体DNA 多聚体。因此在  细胞凋亡晚期 ，DNA 会被降解成更小的片段，断裂的基因组DNA 上暴露出大量的3' -OH 末端，更容易被TDT酶复合物检测。因此凋亡早期绿光信号较弱，细胞核也相对完整，凋亡信号与细胞核基本重合。细胞凋亡晚期，DNA 会被降解成较小的片段，DAPI 着色较浅或者近乎没有，此时也暴露大量3'-OH末端，结合更多的TDT绿光信号复合物，所以到晚期可能出现，只有很强的绿光信号， DAPI光很弱或者没有的结果。

正常的心、肝、肺、肾、脑等组织一般没有明显凋亡信号，如做了其他处理诱  导组织发生凋亡则会出现大量凋亡信。  (如心梗处、脑梗处凋亡信号会很明显肿瘤的坏死处表达也会很强)

注意事项：

1.蛋白酶K处理时间不能过久(植物，细胞一般5min 动物组织20min),  否则会导致细胞核受损染不上DAPI,  处理时间太短会导致Tunel  信号不明显或无法标记完整。

2.蛋白酶k处理后需要反复冲洗干净，避免出现绿光片状不均匀，影响表达的观察。

3.试剂盒使用后及时放回常用保存温度，避免影响效价。

4.孵育温度保持稳定，孵育完冲洗干净，避免结果不均匀。

本产品仅供科研使用，不用于临床诊断！

（ 产品包装升级中，请以实物为准）