同源荧光双标是一种新型荧光分子标记技术，其无论在生物医学领域还是生物化学领域都具有广泛的应用前景。在生物学研究中，常常需要对生物分子进行标记以便于定位和观察，而同源荧光双标技术则为我们提供了一个高效且可靠的标记选择.
在同源荧光双标实验中，各位小伙伴有没有遇到串色问题呢？是否有过疑问：同源荧光双标串色正常吗、同源荧光双标为什么会串色等问题.皮诺飞生物今天就以实验室多年实验经验分享给大家！
一般在两种或两种以上荧光素之间,如果荧光发射峰很近,那么荧光光谱彼此会有部分重叠,检测时可能出现一种荧光素的信号扩散到另一荧光通道的情况，这种现象称为串色或荧光光谱交叉(crosstalk)。
同源荧光双标实验流程及步骤
样本前处理
（1）石蜡切片
脱蜡：将切片依次浸泡于二甲苯1（15min）、二甲苯2（15min）、无水乙醇1（5min）、无水乙醇2（5min）、95%乙醇（5min）、85%乙醇（5min）、75%乙醇（5min），最后用水漂洗片子。
（2）冰冻切片
组织固定：切片稍晾干 ，用通用组织固定液室温固定15min，取出切片水洗。
实验步骤：
1.抗原修复
抗原修复通常使用1×柠檬酸（PH6.0）作为修复液，高温高压修复，将切片至于高压锅中，加入适量的修复液，关上高压锅，待冒起后计时，计时2min，冷却至室温，修复完毕。如遇表达较弱的指标，则可用EDTA（PH9.0）作为修复液进行抗原修复。
如遇骨组织、脑组织等易掉片组织，则采用微波修复或者胰蛋白酶修复，修复温度控制在80℃以下，修复液可用2×柠檬酸（PH6.0），自然冷却。
2.内源性酶阻断
组化笔画圈圈住组织，将3%过氧化氢溶液滴加在切片上，一片组织约50ul染液，于室温孵育20min。
3.血清封闭
采用与一抗不同来源的血清（通常使用10%山羊血清）进行封闭，37℃孵育30min。
4.一抗孵育
使用抗体稀释液按照一定浓度稀释一抗（参考抗体官网或者咨询www.pinuofei.com），4℃过夜孵育或者37℃孵育2h。
5.二抗孵育（使用与一抗同来源标记的二抗）
滴加与一抗同来源标记的二抗，每张切片滴加50ul二抗即可，37℃孵育1h。
6.孵育TSA试剂
使用TSA buffer稀释TYR-488,在组织上滴加稀释好的TYR-488，37℃孵育30min，再用PBS洗涤3次，每次5min。
7.抗原修复
将玻片至于1×柠檬酸中，放入微波炉高火修复5min，冷却至室温。
8.血清封闭
采用与一抗不同来源的血清（通常使用10%山羊血清）进行封闭，37℃孵育30min。
9.一抗孵育
使用抗体稀释液按照一定浓度稀释一抗（参考抗体官网），4℃过夜孵育。
10.二抗孵育（使用与一抗同来源标记的二抗）
| 荧光素名称 | 最大激发波长(nm） | 最大发射波长 (nm） | 图片颜色 |
| TYR-555（CY3） | 550 | 570 | 红色 |
| TSA-488 | 490 | 520 | 绿色 |
滴加与一抗同来源标记的二抗，每张切片滴加50ul二抗即可，37℃孵育1h。
11.孵育TSA试剂
使用TSA buffer稀释TYR-555（CY3），在组织上滴加稀释好的TYR-555（CY3），37℃孵育30min，再用PBS洗涤3次，每次5min。
12.DAPI染核
将DAPI工作液滴加到组织上，每张切片100ul左右，室温孵育-2-5 min，再用PBS洗涤3次，每次5min。将液体甩干，在组织上滴加抗荧光封片剂，盖上盖玻片。将做好的荧光片子至于4℃避光保存。
