（1）石蜡切片

脱蜡：将切片依次浸泡于二甲苯1（15min）、二甲苯2（15min）、无水乙醇1（5min）、无水乙醇2（5min）、95%乙醇（5min）、85%乙醇（5min）、75%乙醇（5min），最后用水漂洗片子。

（2）冰冻切片

组织固定：切片稍晾干 ，用通用组织固定液室温固定15min，取出切片水洗。

实验步骤：

1.抗原修复

抗原修复通常使用1×柠檬酸（PH6.0）作为修复液，高温高压修复，将切片至于高压锅中，加入适量的修复液，关上高压锅，待冒起后计时，计时2min，冷却至室温，修复完毕。如遇表达较弱的指标，则可用EDTA（PH9.0）作为修复液进行抗原修复。

如遇骨组织、脑组织等易掉片组织，则采用微波修复或者胰蛋白酶修复，修复温度控制在80℃以下，修复液可用2×柠檬酸（PH6.0），自然冷却。

2.内源性酶阻断

组化笔画圈圈住组织，将3%过氧化氢溶液滴加在切片上，一片组织约50ul染液，于室温孵育20min。

3.血清封闭

采用与一抗不同来源的血清（通常使用10%山羊血清）进行封闭，37℃孵育30min。

4.一抗孵育

使用抗体稀释液按照一定浓度稀释一抗（参考抗体官网或者咨询www.pinuofei.com），4℃过夜孵育或者37℃孵育2h。

5.二抗孵育（使用与一抗同来源标记的二抗）

滴加与一抗同来源标记的二抗，每张切片滴加50ul二抗即可，37℃孵育1h。

6.孵育TSA试剂

使用TSA buffer稀释TYR-488,在组织上滴加稀释好的TYR-488，37℃孵育30min，再用PBS洗涤3次，每次5min。

7.抗原修复

将玻片至于1×柠檬酸中，放入微波炉高火修复5min，冷却至室温。

8.血清封闭

采用与一抗不同来源的血清（通常使用10%山羊血清）进行封闭，37℃孵育30min。

9.一抗孵育

使用抗体稀释液按照一定浓度稀释一抗（参考抗体官网），4℃过夜孵育。

10.二抗孵育（使用与一抗同来源标记的二抗）

滴加与一抗同来源标记的二抗，每张切片滴加50ul二抗即可，37℃孵育1h。

11.孵育TSA试剂

使用TSA buffer稀释TYR-555（CY3），在组织上滴加稀释好的TYR-555（CY3），37℃孵育30min，再用PBS洗涤3次，每次5min。

12.DAPI染核

将DAPI工作液滴加到组织上，每张切片100ul左右，室温孵育-2-5 min，再用PBS洗涤3次，每次5min。将液体甩干，在组织上滴加抗荧光封片剂，盖上盖玻片。将做好的荧光片子至于4℃避光保存。