一、引言概述

原位杂交检测是一种通过在组织、细胞或染色体样本中，使用标记的核酸探针与互补靶序列特异性结合，从而对目标 DNA 或 RNA 进行精确定位、定性和相对定量的技术。其核心特征在于在形态学完整的背景下保留目标核酸的空间分布信息，这对于理解基因表达模式、染色体结构、细胞异质性及病原体检测具有至关重要的生物学意义。

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二、核心机制解析：高分辨率成像如何实现原位信号的精准捕获

原位杂交的成功最终依赖于对微弱、离散的杂交信号进行精准成像。高分辨率成像技术超越了传统宽场荧光显微镜的衍射极限，其核心机制在于通过物理或算法方法，实现亚细胞乃至分子水平的分辨率。

【图片提示】：一张对比图。左侧为传统宽场显微镜下的图像，信号呈模糊光斑，定位不清；右侧为高分辨率图像（如 STED 或 STORM），清晰显示单个 mRNA 斑点（puncta）在细胞质中的精确分布，甚至可区分两个相距 < 100 nm 的不同 mRNA 分子。

1. 突破衍射极限：传统光学显微镜分辨率受阿贝衍射极限限制（~200 nm）。高分辨率技术通过以下方式突破：

◦ Stimulated Emission Depletion (STED)：使用一束激发光和一环状耗尽光，将有效荧光光斑缩小至纳米级别。

◦ 单分子定位显微镜 (SMLM，如 STORM/PALM)：通过时序激活稀疏分布的单个荧光分子，进行精确定位和重构，最终合成超高分辨率图像。

◦ 结构光照明显微镜 (SIM)：通过调制光场，将高频信息移至光学系统可探测的低频范围，通过算法重建，将分辨率提升约 2 倍（~100 nm）。

1. 关键分子过程：高分辨率成像与原位杂交的结合，要求探针标记的荧光团具有高亮度、高光稳定性和特异性激活 / 开关特性（尤其对 SMLM）。信号的精准解读依赖于高数值孔径 (NA) 物镜、高灵敏度探测器（如 sCMOS）和去卷积算法对原始数据的处理。

三、检测与分析方法系统汇总

1. 形态学观察：高分辨率共聚焦显微镜 (Confocal)

• 原理：利用针孔排除焦平面以外的散射光，获得光学切片，显著提高图像对比度和轴向分辨率。

• 检测指标：信号的亚细胞共定位分析（如 mRNA 与特定细胞器的关系）、三维重构观察信号在组织中的空间分布。

• 步骤 / 试剂：标准 FISH 流程后，使用高 NA 油镜（如 63×/1.4 NA），并设置合适的Z 轴步进尺寸（通常 < 0.5 μm） 进行三维扫描。常用Alexa Fluor®、Cy® 系列等光稳定染料。

• 优点：技术成熟，广泛应用；能有效消除厚样本的杂散光干扰。

• 缺点：分辨率仍受衍射极限限制；激光可能引起荧光淬灭。

2. 生化指标定量：超分辨显微镜 (STED/SIM)

• 原理：通过物理方法直接提升光学分辨率至衍射极限以下。

• 检测指标：单个 RNA 转录本的计数与精确定位、染色质 Territories 的纳米结构、病毒核酸与宿主蛋白的相互作用距离。

• 步骤 / 试剂：需要特殊的显微镜系统和兼容的荧光探针。对于 STED，常使用耐淬灭染料（如 Abberior STAR 系列）；对于 SMLM，需使用光开关染料（如 Cy5-Cy3 对） 和成像缓冲液。

• 优点：分辨率极高（20-50 nm），可揭示纳米尺度的生物学结构。

• 缺点：设备昂贵；样品制备和图像采集时间长；对样品标记和固定要求极高。

3. 关键分子标志物检测：多重荧光 FISH (Multiplex FISH)

• 原理：通过轮询标记（Sequential Labeling and Imaging）或组合标记（Using Barcoded Probes）策略，在单一样本中同时检测多种靶核酸。

• 检测指标：多个基因的表达谱及其空间关系、等位基因特异性表达。

• 步骤 / 试剂：设计特异性探针池（Probe Pools），使用酪胺信号放大 (TSA) 系统或RNAscope® 等商业化技术提升灵敏度。每轮杂交成像后，需进行荧光淬灭或剥离。

• 优点：极大丰富单次实验的信息量，揭示细胞异质性和基因调控网络。

• 缺点：实验流程复杂漫长；多次处理可能导致样品损伤或信号丢失。

4. 功能验证：活细胞动态成像

• 原理：将 FISH 与活细胞成像技术结合，使用分子信标 (Molecular Beacons) 或MS2/PP7 系统（与噬菌体衣壳蛋白融合） 标记 RNA，实时追踪其转录、运输和降解 Dynamics。

• 检测指标：RNA 生命周期的动力学参数（如合成速率、扩散系数）。

• 步骤 / 试剂：需使用对环境敏感且细胞穿透性的荧光探针。在37°C、5% CO₂ 环境下，于共聚焦显微镜上进行长时间序列拍摄。

• 优点：提供动态信息，是强有力的功能验证手段。

• 缺点：技术难度高；过表达标签可能干扰正常生物学过程；光毒性影响细胞活性。

四、必备实验对照设计

为确保结论可靠，必须设置以下对照：

1. 阴性对照：

◦ 无探针对照：排除样本自发荧光的干扰。

◦ Sense 探针对照：使用与靶序列相同的正义链探针，评估非特异性结合。

◦ RNase/DNase 预处理对照：酶消化靶核酸后，信号应消失，证明信号来源于核酸而非蛋白或其他成分。

1. 阳性对照：使用已知高表达靶序列的细胞系或组织切片，验证整个实验流程的有效性。

2. 特异性对照（排除干扰）：

◦ 使用多种不同靶向同一基因的探针，结果应一致。

◦ 进行RNAi 敲低或 CRISPR 敲除后，信号应显著减弱或消失，这是最有力的特异性证明。

◦ 若研究某通路对基因表达的影响，需设置通路激动剂 / 抑制剂对照。

五、常见问题与优化策略

1. 问题：信号弱或无信号

• 解决方案：

a. 优化固定与透化步骤：避免过度交联（4% PFA 短时间固定），测试 Triton X-100、Tween-20 等透化剂浓度和时间。

b. 使用信号放大系统，如 TSA 或商业化的 RNAscope/ViewRNA。

c. 延长杂交时间或提高探针浓度，并确保杂交温度准确。

2. 问题：背景噪音高

• 解决方案：

a. 增加杂交后洗涤的严格性（如降低盐浓度、加入甲酰胺、提高洗涤温度）。

b. 优化封闭步骤，使用鲑鱼精 DNA、tRNA或商业封闭剂有效封闭非特异性位点。

c. 确保抗体（若涉及）的高特异性，并进行预吸附。

3. 问题：高分辨率成像下形态不佳或信号漂白过快

• 解决方案：

a. 使用更温和的固定剂，如多聚甲醛 - 戊二醛混合固定液（注意浓度，戊二醛过高会引起自发荧光）。

b. 添加抗淬灭封片剂（如 ProLong Diamond）。

c. 对于 SMLM，优化成像缓冲液以维持荧光分子的开关循环。

六、结果解读与数据分析

（一）典型结果解读

• 【图片提示】：共聚焦图像应显示清晰的、离散的点状信号，分布于预期的细胞区域（如胞浆、核仁）。可通过共定位分析（如 Manders' 系数、Pearson's 系数） 进行量化。

• 【图片提示】：超分辨图像应能分辨出传统显微镜下无法区分的、密集分布的单个信号点。可进行团簇分析（Cluster Analysis） 或距离测量到特定亚细胞结构。

• 任何定量结论必须基于至少三个独立生物学重复的统计检验。

（二）数据交叉验证

1. 将FISH 的定位结果与qPCR 的定量结果相关联（虽然 qPCR 无空间信息，但整体表达趋势应一致）。

2. 使用免疫荧光（IF） 检测相应蛋白，其空间分布应与 mRNA 的 FISH 信号有合理的相关性（考虑到翻译和运输的时空调控）。

七、技术前沿与扩展

1. 空间转录组学 (Spatial Transcriptomics)：将高通量测序与原位成像结合，在保留空间位置信息的前提下，一次性获得整个转录组的表达数据，是 FISH 技术的革命性延伸。

2. 膨胀显微镜 (ExM)：将生物样本物理性放大，使得普通共聚焦显微镜即可实现～70 nm 的有效分辨率，极大降低了超分辨成像的门槛。

3. 多组学整合成像：在同一样本上同时实现转录组（FISH）、蛋白质组（IF）和表观遗传组（如 HiChIP）的原位分析，构建完整的空间多组学图谱。

八、总结与展望

（一）最关键的操作与理论要点

• 样本制备是基石：温和而有效的固定与透化是成功的关键。

• 对照设计是生命线：没有严谨的对照，任何结论都立不住脚。

• 探针设计与标记是核心：选择特异性高、亮度强的探针系统。

• 成像系统匹配是保障：根据分辨率、Multiplexing 能力和动态分析需求选择合适的显微镜平台。

• 定量分析是升华：从 “看到” 到 “量化”，是发表高水平研究的必要条件。

（二）展望

未来，高分辨率原位成像将朝着更高通量、更低成本、更活体动态的方向发展。人工智能（AI）的深度介入将革命性地提升图像分析的速度与准确性，自动识别细胞类型并解析复杂的空间互作关系。最终，我们将能在接近天然的状态下，以分子分辨率全景式地揭示生命过程的动态蓝图。

九、参考文献 / 延伸阅读

1. Gall, J. G., & Pardue, M. L. (1969). Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proceedings of the National Academy of Sciences, 63(2), 378–383.（奠基性论文）

2. Crosetto, N., Bienko, M., & van Oudenaarden, A. (2015). Spatially resolved transcriptomics and beyond. Nature Reviews Genetics, 16(1), 57–66.（权威综述）

3. Levesque, M. J., & Raj, A. (2013). Single-chromosome transcriptional profiling reveals chromosomal gene expression regulation. Nature Methods, 10(3), 246–248.（单细胞水平 FISH 应用的典范）